As técnicas de blotting envolvem a separação (via eletroforese) e a transferência de ADN, ARN ou proteínas para uma membrana de blotting. O ADN alvo é depois ligado a uma molécula com o objetivo de auxiliar a sua deteção. O Southern blotting é usado para avaliar sequências de ADN específicas e pode ser usado na identificação de mutações genéticas e na medicina forense. O Northern blotting concentra-se nas sequências de ARN e é útil na avaliação da expressão génica. O Western blotting identifica proteínas e anticorpos e possui aplicações no diagnóstico de doenças infeciosas, alterações de proteínas (como na doença priónica) e condições autoimunes. Embora estes testes possuam uma boa especificidade, têm desvantagens significativas devido ao seu custo, ser trabalhoso e tempo de resposta lento.
Última atualização: Aug 9, 2022
Blotting é uma técnica de investigação usada para detetar e identificar macromoléculas, como os ácidos nucleicos e as proteínas. Esta técnica é realizada por:
Os 4 tipos básicos de blotting são
| Técnica | Southern blot | Northern blot | Western blot |
|---|---|---|---|
| Alvo | Sequências de ADN | Sequências de RNA | Proteína |
| Separação | Eletroforese | Eletroforese | Eletroforese |
| Método de blotting | Transferência capilar | Transferência capilar | Transferência eletroforética |
| Sonda | Oligonucleotídeos | Oligonucleotídeos | Anticorpos |
| Métodos comuns de deteção |
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Todas as técnicas de blotting usam eletroforese, que envolve o uso de um campo elétrico para separar as moléculas.
As técnicas de blotting seguem um procedimento geral:
Procedimento para o Southern blotting:
A: O ADN é clivado com enzimas de restrição e separado por eletroforese.
B: Os fragmentos de ADN são transferidos para um filtro de nitrocelulose.
C: O filtro é exposto a uma solução que contém uma sonda radiomarcada, permitindo a hibridização com sequências de ADN alvo.
D: As bandas no filtro são então expostas ao filme de raios-X para visualização.
Procedimento para o Western blotting:
A: As amostras de proteínas são carregadas num gel e separadas por eletroforese.
B: As proteínas separadas são transferidas eletroforeticamente para uma membrana.
C: A membrana é incubada com um anticorpo primário específico para a proteína alvo, que permite a formação de complexos anticorpo-antigénio.
D: A membrana é incubada novamente com anticorpos secundários marcados, que se ligam aos anticorpos primários.
E: Neste caso, é adicionado um substrato que interage com os marcadores, permitindo a deteção por quimioluminescência.
SDS-PAGE, pela sigla em inglês: eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida
Western blotting de Borrelia burgdorferi:
A, B e C: Controlos positivos para anticorpos monoclonais específicos
D e E: Indivíduos seropositivos para IgM
F: Controlo positivo
G: Controlo negativo
H: Controlo branco (solução salina tamponada com fosfato)
MW, pela sigla em inglês: peso molecular
O Northern blotting pode ser usado para avaliar os níveis de ARN e a expressão génica.
Identificação de anticorpos:
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