Técnicas de Blotting

Visão Geral

Definição

Blotting é uma técnica de investigação usada para detetar e identificar macromoléculas, como os ácidos nucleicos e as proteínas. Esta técnica é realizada por:

• Separação por eletroforese
• Transferência para uma membrana
• Deteção com uma sonda marcada

Tipos de blotting

Os 4 tipos básicos de blotting são

• Southern
• Northern
• Western
• Eastern (raramente usado em ambiente clínico)

Comparação das técnicas de blotting

Eletroforese

Todas as técnicas de blotting usam eletroforese, que envolve o uso de um campo elétrico para separar as moléculas.

• As moléculas são separadas por:
  • Tamanho
  • Carga elétrica
• Usada extensivamente na análise de:
  • ADN
  • ARN
  • Proteínas
• Tipos:
  • Cataforese: eletroforese de catiões
  • Anaforese: eletroforese de aniões
• Técnica:
  • A amostra é depositada num gel.
  • O gel é colocado numa solução tampão.
  • Aplica-se um campo elétrico.
  • A corrente elétrica separa as moléculas.

Procedimento

Técnica geral de blotting

As técnicas de blotting seguem um procedimento geral:

• A molécula alvo numa amostra é isolada.
• A eletroforese separa as moléculas.
• O conteúdo separado é transferido (ou blotted) para um filtro ou membrana para produzir uma “impressão”.
• O filtro/membrana é então exposto a sondas radiomarcadas e incubado → a sonda liga-se à molécula alvo
• A sonda e a molécula alvo criam bandas que podem ser visualizadas com filme de raios-X.
• Observação: a sonda e os métodos de deteção também podem usar:
  • Colorimetria
  • Quimioluminescência

Southern blotting

• São necessárias enzimas de restrição para clivar a amostra de ADN em fragmentos, antes da eletroforese
• Antes do blotting, o ADN de fita dupla separado é desnaturado com solução alcalina → fragmentos de ADN de fita simples
• Método de blotting: transferência capilar de ADN de um gel de eletroforese para um filtro
• Usa sondas oligonucleotídicas marcadas que são complementares à sequência do ADN alvo
• A incubação permite a hibridização da sonda com o ADN alvo.

Northern blotting

• Método de transferência: transferência capilar de ARN de um gel de eletroforese para um filtro
• Usa sondas oligonucleotídicas marcadas que são complementares à sequência de ARN alvo
• A incubação permite a hibridização da sonda com o ARN alvo.

Western blotting

• As proteínas da amostra são aplicadas a um gel de electroforese. (Em certas situações, as proteínas devem ser desnaturadas antes de serem aplicadas).
• Método de blotting: As proteínas são transferidas eletroforeticamente (usando um campo elétrico) do gel para a membrana de blotting.
• Usa anticorpos específicos para a proteína alvo; este anticorpo pode ser:
  • Não marcado ou primário (mais comum) → em caso afirmativo, é usado um anticorpo secundário marcado que pode ligar-se ao anticorpo primário
  • Marcados (menos comum)
• A incubação permite a formação de complexos anticorpo-antigénio.

Usos

Southern blot

• Pode detetar:
  • Pequenas e grandes mutações de ADN:
    • Exclusões
    • Duplicações
    • Rearranjos
  • Alterações na metilação do gene
• Aplicações:
  • Medicina forense
  • Identificação de novas mutações causadoras de doenças
  • Diagnóstico de doenças genéticas
  • Identificação de marcadores genéticos específicos de malignidade (e.g., fusão do gene BCR-ABL1 na LMC)

Northern blot

O Northern blotting pode ser usado para avaliar os níveis de ARN e a expressão génica.

Western blot

Identificação de anticorpos:

• Diagnóstico de doenças infeciosas, incluindo:
  • HIV
  • Doença de Lyme
  • Infeções por Rickettsia
• Identificação de proteínas e anticorpos anormais, incluindo:
  • Doença priónica
  • Distrofia muscular (análise da distrofina)
  • Autoanticorpos (e.g., anticorpos antimembrana basal glomerular (MBG))

Vantagens e Desvantagens

Vantagens

• Todos os tipos: boa especificidade
• Southern blot: pode detetar uma grande variedade de mutações
• Western blot:
  • Boa sensibilidade
  • Pode avaliar várias proteínas alvo

Desvantagens gerais

• Requer uma grande quantidade de ADN ou ARN
• Processo lento e trabalhoso
• Caro
• O uso de materiais radioativos pode ser potencialmente perigoso.