Modificações Pós-transcricionais (Processamento de RNA)

Descrição Geral

Transcrição

A informação genética do DNA é copiada para o RNA mensageiro (mRNA).

• Neste processo, o mRNA é sintetizado do terminal 5′ para o terminal 3′.
• A transcrição inicial é conhecida como RNA nuclear heterogéneo (hnRNA) ou pré-mRNA.

Modificações

As transcrições primárias, ou produtos imediatos da transcrição, sofrem alterações para se tornarem biologicamente funcionais.

• mRNA:
  • Procariontes: A maioria dos mRNAs primários não tem modificações.
  • Eucariontes: O transcrito sintetizado de mRNA (ou hnRNA) é processado antes de sair do núcleo.
    • Adição do cap 5′
    • Adição da cauda 3′ de poli-A
    • Splicing
  • A modificação de hnRNA produz mRNA maturado, que é transportado para o citoplasma através de poros nucleares.
  • Em alguns casos, a edição de RNA ocorre com modificações de bases, criando uma sequência diferente daquela copiada do DNA.
  • Uma sequência diferente de mRNA produz uma proteína diferente; isto varia da velha hipótese de “um gene—um polipéptido”.
• RNA de transferência (tRNA) e RNA ribossomal (rRNA):
  • Moléculas estruturais que não são traduzidas
  • Ambos têm pré-tRNA e pré-rRNA que sofrem processamento.

Adição do Cap 5′ e da Cauda 3′ de Poli-A

Cap 5′

7-Metilguanosina (resíduo de guanilil metilado) é adicionado à extremidade 5′ do hnRNA via:

• Remoção do grupo fosfato da ponta no terminal 5′ por RNA trifosfatase
• Transferência de monofosfato de guanosina (GMP pela sigla em inglês) do grupo trifosfato de guanosina pela guanilil transferase
• Metilação da guanina pela guanina-7-metiltransferase (grupo metil de S-adenosilmetionina(SAM))

Funções:

• Evita a degradação pela exonuclease
• Sequência de reconhecimento para tradução

Cauda 3′ de Poli-A

50 a 250 resíduos de adenilil (AMP pela sigla em inglês) são adicionados à extremidade 3′ do hnRNA via:

• Corte de cerca de 20 nucleótidos a jusante de uma sequência de reconhecimento AAUAA
• Adição (e extensão até 250 nucleotídeos) de cauda de poli-A (gerada a partir de ATP) pela polimerase de poli-A

Função:

• Evita a degradação no citosol por exoribonucleases 3′
• Estabiliza o mRNA

Splicing Heterogéneo de RNA Nuclear

Exões e intrões

RNA heterogéneo nuclear (pré-mRNA) contém:

• Secções codificantes chamadas exões (sequências expressas)
• Secções não codificantes chamadas intrões (sequências intervenientes)

Processamento:

• O hnRNA necessita de processamento (splicing) para produzir o mRNA com as devidas sequências de codificação.
• Ocorre na maioria dos genes eucarióticos, mais frequentemente no mRNA

Splicing

• Remoção de intrões do hnRNA/pré-mRNA, simultaneamente à ligação de exões, para formar mRNA maturado
• O processo envolve hnRNA e componentes adicionais:
  • Pequenas ribonucleoproteínas nucleares (que são constituídas por pequenos RNA nucleares (snRNA) e proteínas)
  • Outras proteínas de ligação
• Junções onde ocorre a reação de splicing:
  • Locais do splicing:
    • Áreas onde são feitos cortes entre o exão e o intrão
    • As sequências base identificam estes locais, um no lado 5′ (início do intrão) e o outro no lado 3′ (fim do intrão).
    • Sítio 5’/sítio do dador splicing: GU invariável
    • Sítio 3’/sítio do aceitador de splicing: AG invariável
  • Local da ramificação: localizado a montante do sítio 3′.
• Mecanismo:
  1. Pequenas ribonucleoproteínas nucleares reconhecem os locais de splicing e o local da ramificação devido às sequências base no hnRNA.
  2. hnRNA, pequenas ribonucleoproteínas nucleares e outras proteínas combinam-se para formar o spliceossoma.
  3. O complexo spliceossoma faz um corte no local de splicing 5′ dador (ocorre através de um ataque nucleofílico por um resíduo de adenilil no local da ramificação).
  4. O agora livre terminal 5′ do intrão liga-se ao local da ramificação, formando uma estrutura em loop ou laço.
  5. O local de splicing 3′ é reconhecido, e o segundo corte ocorre lá. Segue-se a libertação do laço, e os 2 exões são unidos para formar o RNA maturado
• Ocorre simultaneamente com o cap 5′ e as modificações da cauda 3′ de hnRNA
• Patologias relacionadas:
  • β-talassémia:
    • Contém defeitos no splicing do mRNA do gene β-globulina
    • Mutações homozigóticas significativas (talassémia major) resultam em anemia dependente de transfusão
  • Atrofia muscular espinhal:
    • Falta de funcionamento do gene SMN1 devido a mutação
    • O SMN2 restante é incapaz de compensar devido ao defeito ao nível de splicing pré-MRNA (omissão do exão 7).

Splicing alternativo

• Splicing diferencial de uma sequência hnRNA
• Mecanismos:
  • Os exões são seletivamente incluídos ou excluídos.
  • São utilizados locais alternativos de dadores 5′ ou aceitadores 3′.
  • Os locais de poliadenilação podem ser diferentes.
• Até 95% dos genes multiexão sofrem splicing alternativo (SA) para codificar proteínas com diferentes funções celulares.
• SA é uma etapa de regulação de resposta rápida necessária para uma síntese de proteínas aperfeiçoada, e assim determinar os fenótipos celulares e as taxas de proliferação.
• Cerca de 15% das doenças hereditárias e cancros estão reportados como sendo associados ao SA.
• Diferentes combinações de exões podem levar à criação de diferentes proteínas relacionadas a partir do mesmo hnRNA:
  • Moléculas de imunoglobulina (genes para cadeias pesadas possuem exões relacionados a subtipos individuais)
  • Variantes de tropomiosina no músculo
  • Recetores de dopamina no cérebro (recetores D2 com 2 isoformas)

Edição de RNA

Geralmente, a sequência de DNA é refletida no mRNA maturado. A alteração da sequência ou edição do RNA é uma exceção.

Definição

• Uma alteração na informação codificante após a transcrição resulta numa sequência de RNA diferente da sequência do seu DNA original.
• Acredita-se que contribui para a regulação genética
• Processos:
  • Mudanças de bases
  • Exclusão de bases
  • Inserções de bases

Mudanças de bases

Edição “C-para-U”:

• Gene da apolipoproteína B(apoB): Os mesmos códigos genéticos para ApoB100 (sintetizado no fígado) e ApoB48 (sintetizado no intestino).
• No intestino:
  • Desaminação da citosina (para uracilo) catalisada pela enzima citidina desaminase.
  • Codão CAA (citidina–adenina–adenina) (no mRNA) → UAA (uridina–adenina–adenina), um sinal de fim ou um codão de paragem
• Como resultado desta edição:
  • ApoB100 é uma proteína de 100 kDa constituída por 4536 aminoácidos.
  • ApoB48 é uma proteína mais curta de 48 kDa constituída por 2152 aminoácidos.
  • A mudança produz ApoB48, que não tem o domínio C-terminal de ApoB100 (responsável pela ligação dos recetores LDL).

Edição “A-para-I”:

• Afeta os substratos de RNA de cadeia dupla
• Desaminação da adenina (a hipoxantina) catalisada por ADAR (adenosina desaminase que atua no RNA)
• Adenosinas convertidas em inosinas, o que leva a substituições de bases A para G
• Gera locais de splicing alternativo

Inserções/exclusões

• Ocorre em tripanossomas e protozoários relacionados, afetando o mRNA mitocondrial
• Envolve adição ou eliminação de uridina

RNA Ribossomal e Processamento de RNA de Transferência

RNA Ribossomal

• Em procariontes:
  • Como estudado em Escherichia coli, existem 3 tipos de rRNA (5S, 16S e 23S) que têm transcrições primárias policistrónicas.
  • Processamento inicial da transcrição via clivagem endonucleolítica por RNases → pré-rRNA
  • As extremidades 5′ e 3′ do pré-RNA são então cortadas por outro conjunto de RNases.
  • A metilação ocorre durante a montagem de ribossomas para proteger contra a degradação.
• Em eucariontes, a transcrição primária é uma grande molécula precursora 45S:
  • Contém moléculas de rRNA (28S, 18S e 5,8S) com sequências de distanciadoras no meio
  • Processado no nucléolo:
    • Por metilação em vários locais (facilitada por pequenos RNAs nucleolares (snoRNA))
    • Posteriormente, por corte do RNA
  • O quarto tipo de rRNA, 5S, é processado separadamente.
  • Os rRNA maturados resultantes, que se associam com outras proteínas, tornam-se o suporte das unidades ribossómicas no citoplasma.
• Alguns rRNA eucarióticos têm intrões, e nesses, os rRNA pré-rRNAs fazem auto-splicing (agem como ribozimas).

RNA de transferência

• O RNA de transferência é um polinucleótido único composto por uma média de 75 nucleótidos com características únicas:
  • Devido ao dobramento (folding) distinto, as extremidades 5′ e 3′ compõem o braço aceitador.
  • A extremidade 3′ também tem uma sequência CCA (citosina-citosina-adenina).
  • Tem bases modificadas como inosina, dihidrouridina, e pseudouridina
• O precursor tRNA contém:
  • Nucleótidos extra nas extremidades 3′ e 5′.
  • Intrões
• O processamento envolve:
  • A remoção dos nucleótidos e intrões extra
  • Modificação de bases padrão (como a metilação e a desaminação)
  • Utiliza RNase P (uma ribozima) para formar a extremidade 5′.
  • A adição de CCA no final da extremidade 3′ por tRNA nucleotidiltransferase