Mecanismos de Reparação de DNA

Visão Geral dos Danos e Reparos do DNA

Etiologia

Os danos no DNA podem ser causados por:

• Exposições ambientais:
  • Luz solar/radiação UV
  • Radiação
  • Agentes químicos
  • Vírus
  • Alimentação
• Espécies reativas de oxigénio (ROS pela sigla em inglês) produzidas durante processos metabólicos normais
• Erros de replicação
• Idade

Tipos de danos de ADN

• Danos de cadeia simples:
  • A danificação de 1 cadeia permite a utilização da outra cadeia como modelo para reparação.
  • Exemplos de danos de cadeia simples incluem:
    • Quebras numa cadeia do DNA
    • Pares de base incompatíveis
    • Incorporação de uracilo no DNA
    • Oxidação ou alquilação do DNA
• Quebras de cadeia dupla:
  • Ambas as cadeias de DNA são cortadas.
  • Perigoso para a estabilidade do genoma (danos cromossómicos)
  • A ligaçãode cadeias quebradas pode levar à pausa da mitose, morte celular ou mutação.

Mecanismos de reparação de DNA

• Mecanismos usados para corrigir erros de replicação durante a replicação de DNA:
  • Revisão (proofreading)
• Mecanismos para danos de DNA de cadeia simples (após replicação):
  • Fotorreparação (não ativo em humanos)
  • Reparação por excisão de bases
  • Reparação por excisão de nucleótidos
  • Reparação de incompatibilidades
• Mecanismos para quebras de DNA de dupla cadeia (após replicação):
  • Recombinação homóloga
  • Junção de extremidades não homóloga

Revisão e Fotorreparação

Revisão (proofreading)

A revisão ocorre durante a replicação de ADN. A DNA polimerase (o complexo enzimático que replica o DNA):

• Possui atividade de “revisão”, capaz de corrigir erros de replicação
• Pode fazer uma “cópia de segurança” quando um erro é detetado, retirar o nucleótido incorreto e inserir o correto:
  • Possui atividade de exonuclease de 3′ a 5′ permitindo a excisão do nucleótido incorreto
• Melhora 100 vezes mais a fidelidade da cópia do DNA

Fotorreparação

A radiação UV provoca a formação de dímeros de pirimidina (T ou C) através de ligações covalentes entre bases adjacentes, criando uma alteração conformacional (“bulge”) no DNA. Estes defeitos podem ser reparados através de um processo chamado fotorreparação, ou fotorreativação.

• A DNA fotoliase é uma enzima que utiliza a energia da luz visível para quebrar a ligação covalente entre pirimidinas, restaurando o DNA ao seu estado original:
  • Note-se que a luz UV causa os danos; a luz visível fornece a energia para reparar os danos.
• A fotorreparação é um exemplo de inversão direta (ou química) dos danos do DNA (ou seja, não quebra o esqueleto fosfodiéster).
• Não precisa de um DNA modelo
• Pode reparar apenas 1 base de cada vez
• Este processo não está ativo em mamíferos placentários (como os humanos).

Reparação de Danos de DNA de Cadeia Simples

A célula tem 3 mecanismos primários para reparar os danos feitos a uma cadeia simples de DNA:

• Reparação por excisão de bases
• Reparação por excisão de nucleótidos
• Reparação de missmatch

Processo geral de reparação de danos em DNA de cadeia simples

Todos os 3 mecanismos seguem o mesmo processo geral:

1. As bases danificadas ou anormalmente emparelhadas são identificadas.
2. As enzimas de excisão excisam a base ou o nucleótido anormal, ou uma pequena região ao seu redor.
3. A DNA polimerase preenche a lacuna ao adicionar os nucleótidos corretos.
4. ADNA ligase sela esqueleto de fosfato de açúcares com uma nova ligação fosfodiéster.

Reparação por excisão de bases (REB)

Na REB, uma única base danificada é excisada e substituída.

• Enzimas glicosilase:
  • Cortam a ligação entre a base danificada e a desoxirribose, removendo-a.
  • As DNA glicosilases são específicas da lesão.
  • As células têm múltiplas glicosilases de DNA com diferentes especificidades.
  • Exemplos de enzimas de glicosilase:
    • A uracilo-DNA glicosilase remove o uracilo das cadeias de DNA.
    • A oxoguanina glicosilase remove as bases oxidadas.
• As endonucleases removem a porção restante de fosfato de açúcar do nucleótido.
• A DNA polimerase remove o único nucleótido anormal e substitui-o pelo correto.
• A DNA ligase sela o esqueleto.
• Mecanismo de reparação de danos UV em humanos

Reparação por excisão de nucleótidos (REN)

• Processo semelhante ao REC, mas com secções maiores de DNA excisadas
• Toda a secção de DNA (tipicamente, aproximadamente 12-30 pares de bases) que envolve a área anormal é removida por um complexo de endonucleases.
• O DNA é ressintetizado pela DNA polimerase e selado pela DNA ligase.

Reparação de incompatibilidades do DNA (RID)

• Corrige erros no emparelhamento de bases que possam ter ocorrido durante a replicação do DNA e não foram reparados por revisão:
  • Muitas vezes causada pela tautomerização (isómeros estruturais) durante a replicação
  • Podem ser pares de bases simples ou secções maiores de ADN
• Proteínas RID:
  • Localizam os nucleótidos incompatíveis
  • Recrutam exonucleases para a excisão de bases incompatíveis
• Uma vez excisada a base incompatível:
  • A DNA polimerase pode colocar a(s) base(s) correta(s).
  • A DNA ligase sela o esqueleto de fosfato de açúcares.

Reparação de Danos de DNA de Cadeia Dupla

Em geral, é mais difícil reparar danos em DNA de cadeia dupla porque não há nenhuma cadeia modelo em que se basear. Os 2 mecanismos primários para fixar quebras de DNA de cadeia dupla são a recombinação homóloga e a união de extremidades não homóloga.

Recombinação homóloga (RH)

Na recombinação homóloga (RH), é usado como um modelo o quase idêntico cromatídeo irmão ou o cromossoma homólogo

• A mecânica e as enzimas são semelhantes ao cruzamento cromossómico (crossover) que ocorre durante a meiose.
• A RH requer:
  • Extensas regiões de sequências homólogas entre os 2 cromatídeos
  • Vários complexos enzimáticos, incluindo:
    • Exonucleases: começam a digerir as extremidades 5′ → geram caudas de DNA 3′ de cadeia simples nas cadeias partidas
    • Enzimas recombinase: catalisam a inserção da extremidade 3′ na sequência complementar de DNA no cromatídeo homólogo.
• A DNA polimerase é capaz de sintetizar o novo DNA a partir do cromatídeo homólogo.
• A cadeia “invasora” pode acabar por:
  • Ser trocada com a sua região homóloga no cromatídeo oposto:
    • Esta troca é conhecida como uma junção de Holliday, cruzamento, ou crossover.
  • Ser deslocada depois de ter sintetizado DNA suficiente para “atravessar a lacuna” da sua quebra original:
    • A cadeia 3′ original é então reconectado com a sua extremidade 5′ original e usado como um modelo para preencher as lacunas.
    • Conhecido como anelamento dependente de síntese de cadeia simples (SDSA pela sigla em inglês)
  • Copiar o resto do seu cromatídeo irmão se a sua extremidade 5′ original for perdida:
    • Assim que a extremidade 3′ invasora tenha copiado o resto do cromatídeo, é libertada e usada como uma cadeia modelo para refazer a sua cadeia complementar.
    • Este processo é conhecido como replicação induzida por falha (RIF).

Junção de extremidades não homóloga (JENH)

• A DNA ligase IV e o cofator XRCC4 voltam a juntar diretamente as extremidades partidas.
• Baseia-se em micro-homologias (pequenas sequências homólogas) em caudas de cadeias únicas em cadeias partidas
• As deleções, inserções e translocações são mais comuns com este tipo de reparo.
• Um mecanismo semelhante está envolvido na recombinação V(D)J para criação da diversidade de células B e T.

Relevância Clínica

• Distúrbios genéticos: Quando os pares de bases não são reparados dentro dos gâmetas, podem criar mutações que são transmitidas à descendência.
• Cancro: classe de doenças causadas por alterações na sequência genética e na expressão génica. Estas alterações são frequentemente devidas a mutações ou danos no DNA. Existem 4 classes de genes reguladores normais que são frequentemente danificados nas células cancerosas: oncogenes promotores de crescimento, genes supressores da inibição de crescimento de tumores, genes que regulam a apoptose, e genes envolvidos na reparação do DNA.
• Síndrome de Lynch: também conhecido como cancro colorretal hereditário não associado a polipose (CCRHNP). A síndrome de Lynch é causada por uma mutação autossómica dominante nos genes do DNA RID. A síndrome de Lynch é a síndrome do cancro do cólon hereditário mais comum e acarreta um risco significativamente maior de cancro endometrial e outras doenças malignas. O diagnóstico é feito através de testes genéticos. O rastreio precoce e frequente do cancro do cólon é necessário, e a histerectomia profilática é frequentemente recomendada para as mulheres acima da idade reprodutiva.
• Cancros de pele: Os tipos mais comuns de cancros de pele incluem carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular da pele e melanoma. As mutações nestes cancros surgem frequentemente de danos no DNA devido à exposição excessiva à radiação UV. Quando ocorre uma sobrecarga dos sistemas RIC devido à exposição solar frequente, o risco de cancros cutâneos aumenta. Este risco é mais comum em indivíduos de pele clara com um histórico de exposição excessiva ao sol e queimaduras solares. O diagnóstico definitivo é estabelecido com biópsia. O tratamento depende principalmente da excisão cirúrgica.
• Xeroderma pigmentoso: doença autossómica recessiva rara, caracterizada por alterações de pigmentos da pele. A presença de xeroderma pigmentoso leva a um aumento do risco de cancro da pele e das mucosas induzidos por raios UV e, ocasionalmente, de neurodegeneração progressiva. Esta doença é causada por 1 de várias mutações, o que acaba por conduzir a um REN disfuncional. O diagnóstico deve ser suspeito em crianças com sensibilidade solar grave, sardas significativas antes dos 2 anos de idade, e/ou cancro de pele antes dos 10 anos de idade.