Imunoensaios

Visão Geral

Definição

Os imunoensaios são técnicas baseadas em placas, projetadas para detetar e quantificar peptídeos, proteínas, anticorpos e hormonas. O elemento mais crucial da estratégia de deteção é uma reação antigénio-anticorpo altamente específica.

Componentes

• Analito: a molécula de interesse (antigénio)
• Anticorpo: cuidadosamente selecionado para o analito específico
• Marcadores:
  • Moléculas que têm o potencial de se conjugarem com o complexo anticorpo-antigénio
  • Permitem a deteção e quantificação

Tipos de imunoensaios

O tipo de marcação define o imunoensaio que está a ser realizado:

• Enzimas: ELISA (do inglês enzyme-linked immunosorbent assay)
• Moléculas especializadas/marcadores (juntamente com enzimas) que possuem a propriedade de emissão de luz:
  • Quimioluminescência
  • Imunoensaio de fluorescência (FIA, pela sigla em inglês)
• Isótopos radioativos: radioimunoensaio

Procedimento

Processo geral

• É adicionada a uma placa uma amostra/analito.
• São adicionados um anticorpo e um marcador.
• Forma-se um complexo anticorpo-antigénio.
• É realizada uma etapa de lavagem, em alguns ensaios, para remover antigénios/anticorpos não ligados.
• É adicionado um substrato, que reage com o rótulo e resulta em:
  • Mudança de cor (ELISA)
  • Luminescência (quimioluminescência)
  • Fluorescência (FIA, pela sigla em inglês)
  • Emissão de radiação (radioimunoensaio)
• São detetadas alterações/sinais para determinar a presença/quantidade de antigénio numa amostra. Os métodos de deteção podem incluir:
  • Espectrometria (mudança de cor)
  • Luminometria (emissão de luz)
  • Contador gama (radiação)

Variantes de ELISA

Existem 4 tipos principais de ELISA, que são variações do processo geral de imunoensaio:

• ELISA direto:
  • A placa é revestida com um antigénio.
  • Incubação com um anticorpo específico marcado
• ELISA indireto:
  • A placa é revestida com um antigénio.
  • Incubação com um anticorpo primário não marcado (específico para o antigénio)
  • Nova incubação com um anticorpo secundário marcado (específico para o anticorpo primário)
• ELISA sanduíche (o analito é envolvido entre 2 camadas de anticorpos “sanduiche”):
  • É usada uma placa revestida com anticorpo.
  • O antigéniodo analito é adicionado à placa e incubado.
  • Nova incubado, mas agora com um anticorpo marcado
• ELISA competitivo:
  • É usada uma placa revestida com anticorpo (é usada uma placa revestida de antigénio se se estiver a testar um anticorpo específico).
  • É adicionado o antigénio alvo da amostra (ou anticorpo).
  • É adicionado o antigénio alvo marcado (ou anticorpo) e depois lavado.
  • Nota: Ao contrário de outros métodos ELISA, menos cor/ausência de cor indica um resultado positivo.

Usos

Os imunoensaios têm uma ampla gama de aplicações clínicas. Os exemplos listados abaixo não são exaustivos.

Doenças infeciosas

Os imunoensaios podem ser usados para identificar microrganismos diretamente (com base em antigénios ou toxinas) ou avaliar indiretamente os anticorpos para o agente infecioso. Alguns exemplos incluem:

• Deteção de microorganismos:
  • Legionella pneumophila
  • Escherichia coli (toxina)
  • Clostridioides difficile (toxina)
  • Hepatite B
• Deteção de anticorpos:
  • VIH
  • Vírus do Nilo Ocidental
  • Hepatite C
  • Borrelia burgdorferi
  • Treponema pallidum

Deteção e monitorização de neoplasias

Os imunoensaios podem ser utilizados para detetar marcadores tumorais. Alguns exemplos incluem:

• PSA
• Antigénio-125 neoplásico
• Alfafetoproteína (AFP)
• Antigénio carcinoembrionário (CEA, pela sigla em inglês)

Testes de alergia

Os imunoensaios podem ser usados para detetar anticorpos IgE para alergénios específicos:

• Resultado positivo:
  • Indica sensibilização a esse alergénio
  • Não indica necessariamente se esse indivíduo terá uma resposta clínica após a exposição a esse antigénio
• Resultado negativo:
  • Não sugere alergia ao antigénio
  • Não exclui completamente a alergia ao antigénio (principalmente se existir história clínica sugestiva)

Fármacos

A monitorização terapêutica de fármacos é uma aplicação importante dos imunoensaios. Os exemplos incluem a monitorização dos níveis de:

• Digoxina
• Teofilina
• Imunossupressores (e.g., ácido micofenólico, ciclosporina)
• Antibióticos (e.g., amicacina, vancomicina, gentamicina)

Outros usos diagnósticos

Exames laboratoriais adicionais onde os imunoensaios podem ser utilizados incluem:

• Troponina I de alta sensibilidade
• A função da tiroide:
  • Hormona estimulante da tiroide (TSH, pela sigla em inglês)
  • Tiroxina livre (T4) e triiodotironina (T3)
• Nutricional:
  • Folato
  • Vitamina b12
  • Ferritina
  • Vitamina D

Vantagens e Erros

Vantagens

As vantagens dependem do tipo de imunoensaio utilizado; no entanto, geralmente, são:

• Baratos
• Sensíveis
• Específicos
• Relativamente rápidos e convenientes

Fontes de erro

• Reatividade cruzada (os anticorpos reagentes ligam-se a moléculas que são semelhantes ao analito → resultados falsos positivos/falsamente elevados)
• Autoanticorpos (anticorpos endógenos, em vez de anticorpos reagentes) ligam-se ao analito → resultados falsos negativos/falsamente baixos)
• Anticorpos antirreagentes (anticorpos endógenos ligam-se aos anticorpos reagentes → resultados falsos positivos/falsamente elevados)