Técnicas de Transferencia

Las técnicas de transferencia implican la separación (mediante electroforesis) y la transferencia de ADN, ARN o proteínas a una membrana de transferencia. A continuación, el ADN diana se une a una molécula para facilitar su detección. La técnica de Southern blot se usa para evaluar secuencias de ADN específicas y se puede usar en la identificación de mutaciones genéticas y en medicina forense. La técnica de Northern blot se centra en las secuencias de ARN y es útil para evaluar la expresión génica. La técnica de Western blot identifica proteínas y anticuerpos y tiene aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, anormalidades de proteínas (como la enfermedad por priones) y afecciones autoinmunes. Aunque estas pruebas tienen una buena especificidad, tienen desventajas significativas debido a su alto costo, ser procesos laboriosos y tener un tiempo de respuesta lento.

Última actualización: Sep 1, 2022

Responsabilidad editorial: Stanley Oiseth, Lindsay Jones, Evelin Maza

Contenido

Descripción General

Procedimiento

Usos

Ventajas y Desventajas

Referencias

Descripción General

Definición

La transferencia es una técnica de investigación utilizada para detectar e identificar macromoléculas, como ácidos nucleicos y proteínas. Esta técnica se logra mediante:

Separación mediante electroforesis
Transferencia a una membrana
Detección con una sonda marcada

Tipos de transferencia

Los 4 tipos básicos de transferencia son

Southern
Northern
Western
Eastern (rara vez se usa en entornos clínicos)

Comparación de técnicas de transferencia

**Características de las técnicas de transferencia Southern, Northern y Western**
Técnica	Southern blot	Northern blot	Western blot
Diana	Secuencias de ADN	Secuencias de ARN	Proteínas
Separación	Electroforesis	Electroforesis	Electroforesis
Método de transferencia	Transferencia capilar	Transferencia capilar	Transferencia electroforética
Sonda	Oligonucleótidos	Oligonucleótidos	Anticuerpos
Métodos de detección comunes	Radiografía Colorimetría Quimioluminiscencia	Radiografía Colorimetría Quimioluminiscencia	Colorimetría Quimioluminiscencia

Electroforesis

Todas las técnicas de transferencia utilizan electroforesis, que implica el uso de un campo eléctrico para separar moléculas.

Las moléculas son separadas según su:
- Tamaño
- Carga eléctrica
Se utiliza ampliamente en el análisis de:
- ADN
- ARN
- Proteínas
Tipos:
- Cataforesis: electroforesis de cationes
- Anaforesis: electroforesis de aniones
Técnica:
- La muestra se coloca en un gel.
- El gel se coloca en una solución tampón.
- Se aplica un campo eléctrico.
- La corriente eléctrica separa las moléculas.

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Electrophoresis and Western Blot

Procedimiento

Técnica general de transferencia

Las técnicas de transferencia siguen un procedimiento general:

Se aísla la molécula diana en una muestra.
La electroforesis separa las moléculas.
Los contenidos separados se transfieren a un filtro o membrana para producir una «impresión».
Luego, el filtro/membrana se expone a sondas radiomarcadas y se incuba → la sonda se une a la molécula diana
La sonda y la molécula diana crean bandas que se pueden visualizar con una película de rayos X.
Nota: los métodos de sonda y detección también pueden utilizar:
- Colorimetría
- Quimioluminiscencia

Técnica de Southern blot

Se necesitan enzimas de restricción para dividir la muestra de ADN en fragmentos antes de la electroforesis
Antes de la transferencia, el ADN bicatenario separado se desnaturaliza con una solución alcalina → fragmentos de ADN monocatenario
Método de transferencia: transferencia capilar de ADN desde un gel de electroforesis a un filtro
Utiliza sondas de oligonucleótidos marcadas que son complementarias a la secuencia de ADN diana
La incubación permite la hibridación de la sonda con el ADN diana.

Procedimiento para la transferencia de southern — Procedimiento para la técnica de Southern blot:
A: El ADN se escinde con enzimas de restricción y es separado mediante electroforesis.
B: Los fragmentos de ADN se transfieren a un filtro de nitrocelulosa.
C: El filtro se expone a una solución que contiene una sonda radiomarcada, lo que permite la hibridación con las secuencias de ADN diana.
D: Las bandas del filtro se exponen luego a una película de rayos X para su visualización.
Imagen por Lecturio.

Técnica de Northern blot

Método de transferencia: transferencia capilar de ARN de un gel de electroforesis a un filtro
Utiliza sondas de oligonucleótidos marcadas que son complementarias a la secuencia de ARN diana
La incubación permite la hibridación de la sonda con el ARN diana.

Técnica de Western blot

Las proteínas de la muestra se aplican a un gel de electroforesis. (En ciertas situaciones, las proteínas deben ser desnaturalizadas antes de ser aplicadas).
Método de transferencia: las proteínas se transfieren electroforéticamente (usando un campo eléctrico) desde el gel a la membrana de transferencia.
Utiliza anticuerpos que son específicos de la proteína diana; este anticuerpo puede ser:
- No marcado o primario (más común): → si es así, se usa un anticuerpo secundario marcado que puede unirse al anticuerpo primario
- Marcado (menos común)
La incubación permite que se formen complejos antígeno-anticuerpo.

Procedimientos de transferencia western — Procedimiento para la técnica de Western blot:
A: Las muestras de proteínas se cargan en un gel y se separan mediante electroforesis.
B: Las proteínas separadas se transfieren electroforéticamente a una membrana.
C: La membrana se incuba con un anticuerpo primario que es específico de la proteína diana, lo que permite la formación de complejos antígeno-anticuerpo.
D: La membrana se incuba de nuevo con anticuerpos secundarios marcados, que se unen a los anticuerpos primarios.
E: En este caso, se agrega un sustrato que interactúa con los marcadores, lo que permite la detección por quimioluminiscencia.
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (por sus siglas en inglés)
Imagen por Lecturio.

Transferencia de western de b. Burgdorferi — Técnica de Western blot de *Borrelia burgdorferi*:
A, B y C: controles positivos para anticuerpos monoclonales específicos
D y E: Individuos seropositivos para IgM
F: Control positivo
G: Control negativo
H: Control blanco (solución salina tamponada con fosfato)
MW: peso molecular (por sus siglas en inglés)
Imagen: “Western blotting of B. burgdorferi” por *Department of Biomedicine and Biotecnology, Alcalá University, 28871 Alcalá de Henares, Spain*. Licencia: CC BY 3.0

Usos

Southern blot

Puede detectar:
- Pequeñas y grandes mutaciones de ADN:
  - Deleciones
  - Duplicaciones
  - Reordenamientos
- Cambios en la metilación de genes
Aplicaciones:
- Medicina forense
- Identificar nuevas mutaciones causantes de enfermedades
- Diagnóstico de afecciones genéticas
- Identificación de marcadores genéticos específicos de malignidad (e.g., fusión del gen BCR-ABL1 en la leucemia mieloide crónica)

Northern blot

La northern blot se puede utilizar para evaluar los niveles de ARN y la expresión génica.

Western blot

Identificación de anticuerpos:

Diagnóstico de enfermedades infecciosas, incluyendo:
- VIH
- Enfermedad de Lyme
- Infecciones por Rickettsia
Identificación de proteínas y anticuerpos anormales, que incluyen:
- Enfermedades por priones
- Distrofia muscular (análisis de distrofina)
- Autoanticuerpos (e.g., anticuerpos contra la membrana basal glomerular)

Ventajas y Desventajas

Ventajas

Todos los tipos: buena especificidad
Southern blot: puede detectar una amplia variedad de mutaciones
Western blot:
- Buena sensibilidad
- Puede evaluar varias proteínas diana

Desventajas generales

Requieren una gran cantidad de ADN o ARN
Proceso lento y laborioso
Costoso
El uso de materiales radiactivos puede ser potencialmente peligroso.

Referencias

Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997). An improved, rapid Northern protocol. Biochem Biophys Res Comm 238:277–279.
Steiling, K., Christenson, S. (2021). Tools for genetics and genomics: gene expression profiling. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-gene-expression-profiling
Schrijver, I., Zehnder, J.L. (2021). Tools for genetics and genomics: Cytogenetics and molecular genetics. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-cytogenetics-and-molecular-genetics
Gottlieb, G.S. (2019). Clinical manifestations and diagnosis of HIV-2 infection. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/clinical-manifestations-and-diagnosis-of-hiv-2-infection
Hu, L. (2021). Diagnosis of Lyme disease. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/diagnosis-of-lyme-disease
Mitschka, S., Mayr, C. (2020). Northern blot protocol. Retrieved December 29, 2021, from https://www.protocols.io/view/northern-blot-protocol-bqqymvxw
Gavini, K., Parameshwaran, K. (2021). Western blot. StatPearls. Retrieved December 29, 2021, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK542290/
Tomar, M. (2016). Types of blotting. Res Rev J Pharmaceutics Nanotechnol. https://www.rroij.com/open-access/types-of-blotting-.php?aid=79704

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Northern blot

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