Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es una técnica que amplifica exponencialmente fragmentos de ADN para su análisis. El proceso es altamente específico, lo que permite la selección de secuencias genómicas específicas, incluso con cantidades de muestra minúsculas. La PCR cicla múltiples veces a través de 3 fases: desnaturalización del ADN molde, hibridación de un cebador específico con las hebras de ADN individuales y síntesis/elongación de nuevas moléculas de ADN. A partir de ahí, el ADN se puede visualizar con técnicas de análisis como la electroforesis en gel. La velocidad, el bajo costo, la facilidad de uso y la alta sensibilidad y especificidad hacen que esta técnica sea muy útil para las ciencias básicas y biomédicas, y se ha vuelto fundamental en muchas aplicaciones, incluido el análisis forense, el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el diagnóstico y tamizaje de anomalías genéticas.

Última actualización: Ago 2, 2022

Responsabilidad editorial: Stanley Oiseth, Lindsay Jones, Evelin Maza

Contenido

Ventajas y Desventajas

Referencias

Descripción General

Definición

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es una técnica que amplifica secuencias de ADN específicas in vitro y de manera exponencial y se utiliza para el diagnóstico, la identificación de virus y el análisis.

Componentes necesarios

ADN molde (muestra con la secuencia genómica)
Cebadores:
- Oligonucleótidos cuidadosamente diseñados para una secuencia diana específica
- Complementarios al extremo 3′ de la región diana
Bases de nucleótidos libres
ADN polimerasa:
- Debe ser termoestable para sobrevivir varias rondas de calentamiento/enfriamento
- Realiza la replicación

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Polymerase Chain Reaction

Procedimiento

Para amplificar el ADN o el ARN, las siguientes etapas se repiten en ciclos (a menudo hasta 30–40 veces):

Desnaturalización
Hibridación de los cebadores
Síntesis

Desnaturalización

La muestra se calienta a aproximadamente 95°C (aproximadamente 203°F).
Los enlaces de hidrógeno se rompen → separación del ADN en hebras individuales

Pcr stage 1 denaturation — Etapa 1: Desnaturalización
El ADN se desnaturaliza a altas temperaturas, provocando la separación en hebras únicas.
Imagen por Lecturio.

Hibridación de los cebadores

La temperatura se reduce a aproximadamente 50–65°C (aproximadamente 122–149°F).
Los cebadores se unen al extremo 3′ de las hebras de ADN molde.
Sigue la unión de la ADN polimerasa.

Pcr stage 2 annealing of primers — Etapa 2: Hibridación de los cebadores
Los cebadores se hibridan con el extremo 3′ de las hebras de ADN molde al enfriar la muestra.
Imagen por Lecturio.

Síntesis/elongación

La temperatura se aumenta a aproximadamente 70–72°C (aproximadamente 158–162°F).
La ADN polimerasa se activa → agrega nucleótidos libres al extremo 3′ de los cebadores
Crea una nueva hebra de ADN idéntica al molde original

Pcr stage 3 synthesis — Paso 3: Síntesis/elongación
La elongación del ADN es catalizada por una ADN polimerasa termoestable, que agrega nucleótidos libres disponibles complementarios a la hebra del ADN molde, lo que da como resultado una molécula de ADN recién sintetizada. El ADN se calienta a 72°C, la temperatura adecuada para que la ADN polimerasa Taq pueda elongar los cebadores.
Imagen por Lecturio.

Repetición de los ciclos

El ADN recién creado sirve como molde para otros ciclos de PCR.
Se replica el ADN exponencialmente en un factor 2^x, donde x es el número de ciclos de replicación
El segmento de ADN diana se puede amplificar 10⁵–10⁶ veces.

Análisis

Luego, el segmento de ADN amplificado se puede observar con técnicas como la electroforesis en gel.
Los resultados deben compararse con ambos:
- Control positivo
- Control negativo

Variaciones

Hay muchas variaciones de la técnica básica de PCR. Algunos de los más comunes incluyen:

PCR de transcripción inversa
PCR cuantitativa

PCR de transcripción inversa

Utiliza ARN como molde
Usa transcriptasa inversa → crea una hebra complementaria de ADN (híbrido ADN/ARN)
La porción de ARN es degradada por la transcriptasa inversa o ribonucleasa H.
La ADN polimerasa agrega nucleótidos complementarios a la hebra de ADN → molécula de ADN completa
El nuevo ADN se convierte en el molde → pasa por el proceso normal de PCR desde allí

PCR cuantitativa

También llamado PCR en tiempo real
Supervisa la amplificación agregando:
- Sonda fluorescente (secuencia específica)
- Colorante fluorescente (se intercala con el ADN)
Permite detección y visualización con software especializado
Útil para:
- Cuantificación (e.g., carga viral)
- Detección rápida de una secuencia específica (sin necesidad de técnicas de análisis posteriores a la PCR)

Usos

Medicina forense

La PCR permite la comparación de pequeñas muestras de evidencia de ADN de la escena del crimen con el ADN de los sospechosos.
Prueba de paternidad

Genotipificación y secuenciación

Identificación de mutaciones genéticas:
- Permite el diagnóstico de muchas enfermedades genéticas
- Se puede realizar en células embrionarias para determinar si un embrión tiene predisposición a ciertas afecciones
- Puede identificar portadores genéticos → útil para el asesoramiento genético
El reconocimiento de oncogenes alterados puede permitir una terapia dirigida contra el cáncer.
Se puede utilizar para la tipificación de tejidos en la implantación de órganos

Enfermedad infecciosa

La PCR ha mejorado significativamente el potencial diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Puede determinar rápidamente la identidad de microbios que tradicionalmente eran:
- De crecimiento lento en cultivo
- Imposibles de cultivar
Ejemplos:
- VIH
- Virus herpes simple
- SARS-CoV-2
- Influenza
- Mycobacterium
- Borrelia burgdorferi
La PCR cuantitativa permite la cuantificación de la carga microbiana (además del análisis cualitativo).
También se puede utilizar para detectar genes que codifican la resistencia a los antibióticos

Ventajas y Desventajas

Ventajas

Rápida
Bajo costo
Relativamente fácil de usar
Altamente específica
Sensible (permite su uso en tamaños de muestra muy pequeños)
Puede amplificar la replicación del ADN exponencialmente para crear un número casi infinito de copias del ADN diana
La máquina de PCR replica el ADN in vitro:
- No se requieren bacterias
- Sin extracción de ADN

Desventajas

Extremadamente sensible → propenso a errores por contaminación de ARN o ADN
Los cebadores requieren datos de secuencia (solo se pueden usar para identificar la presencia de un gen conocido).
Potencial de los cebadores para hibridarse con otras secuencias similares → amplificación de la secuencia genética incorrecta
Formación de dímeros de cebadores:
- Los cebadores se hibridan entre sí a través de bases complementarias.
- Da como resultado la amplificación del dímero en lugar de la secuencia diana

Referencias

Fan, H, & Robetorye, RS. (2010). Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction. transcriptase-polymerase transcriptase-polymerase chain reaction. Methods Mol Biol. 630:199–213. http://reference.medscape.com/medline/abstract/20300999
Brooks, GF CK, Butel, JS, Morse, SA, & Mietzneron, TA. Principles of diagnostic medical microbiology. In Brooks, GF CK, Butel, JS, Morse, SA, & Mietzneron, TA (Eds.), Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology. New York: McGraw-Hill; 2010.
Wittwer, CT, Herrmann, MG, Moss, AA, & Rasmussen, RP. (2013). Continuous fluorescence monitoring of rapid-cycle DNA amplification. Biotechniques. 54(6):314–20. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23905170/
Ishmael, FT, & Stellato C. (2008). Principles and applications of a polymerase chain reaction: Basic science for the practicing physician. Ann Allergy Asthma Immunol. 101(4):437–43. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18939735/
Smith, CJ, & Osborn, AM. (2009). Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67(1):6-20. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19120456/
Ghannam, MG., & Varacallo, M. (2021). Biochemistry, polymerase chain reaction. [Online] StatPearls. Retrieved December 5, 2021, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK535453/
Raby, BA. (2021). Tools for genetics and genomics: Polymerase chain reaction. In Tirnauer, JS (Ed.), UpToDate. Retrieved December 5, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-polymerase-chain-reaction
National Human Genome Research Institute (2020). Polymerase chain reaction (PCR) fact sheet. National Institute of Health. Retrieved December 5, 2021, from https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Polymerase-Chain-Reaction-Fact-Sheet

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